Expressió, purificació i assajos cristal·logràfics de la proteïna HMGA1b(1-90)

thumbnail

Student

Navallas Ramos, M.Carmen

Document type

Master thesis (pre-Bologna period)

Date

2012

rights

Open AccessOpen Access

Publisher

Universitat Politècnica de Catalunya



Abstract

Les proteïnes HMG (High Mobility Group) són un grup de proteïnes cromosòmiques no histones que van ser anomenades així degut a la seva mobilitat electroforètica. Aquest conjunt de proteïnes està dividit en tres grans subfamílies: les HMGA, les HMGB i les HMGN. Les proteïnes HMGA poden modificar la conformació espacial del DNA, regulant (positivament o negativament) l'expressió de nombrosos gens i influint en molts processos cel·lulars normals com ara el creixement, proliferació, diferenciació i mort cel·lular, i la reparació del DNA. També estan relacionades amb diferents processos patològics, entre ells l'obesitat, la diabetis, l'arteriosclerosi i el càncer. S'ha observat com, en molts tipus de càncers, hi ha una sobre-expressió d'aquestes proteïnes. Se sap que la interacció HMGA-DNA es dóna a través d'uns motius d'unió al DNA anomenats “AT-hooks”, els quals s'uneixen a regions riques en adenines (A) i timines (T) del DNA. En les proteïnes HMGA es troben tres motius AT-hook. Per a comprendre millor el mecanisme d'acció d'aquestes proteïnes, és important conèixer l'estructura tridimensional que formen els complexos DNA-proteïna. Amb aquesta finalitat es persegueix l'obtenció de co-cristalls de la proteïna HMGA1b(1-90) amb oligonucleòtids sintètics rics en seqüències ATs. En primer lloc, s'ha expressat la proteïna HMGA1b(1-90) a partir d'un cultiu bacterià d'Escherichia coli. Seguidament, s'ha purificat aquesta proteïna fins l'alt grau de puresa requerit utilitzant cromatografia de bescanvi iònic seguida de cromatografia de gel-filtració. Posteriorment, s'han realitzat assajos cristal·logràfics per a obtenir els co-cristalls necessaris per a poder resoldre, mitjançant difracció de raigs X, l'estructura tridimensional del complex oligonucleòtid-proteïna. Els dos oligonucleòtids sintètics emprats en aquest projecte són l'A2TA2T2AT2 i el G3A3T3C3. En una última etapa del projecte, s'han realitzat també assajos cristal·logràfics amb un pèptid sintètic que es correspon amb el tercer “AThook” de la proteïna d'estudi i l'oligonucleòtid A2TA2T2AT2.
user

Participating teacher

Files